與PCR實驗室建設(shè)相關(guān)的指導(dǎo)文件主要有四份：
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《醫(yī)療機構(gòu)管理條例》
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《醫(yī)療機構(gòu)臨床實驗室管理辦法》
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《臨床基因擴增檢驗實驗室管理暫行辦法》
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《醫(yī)療機構(gòu)臨床基因擴增實驗室管理辦法》
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臨床PCR實驗室，不但在實驗室設(shè)置及儀器設(shè)備等硬件上要滿足開展臨床檢驗的條件，而且要求實驗室在日常工作要有文件化的工作程序。
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下面就在PCR實驗室建設(shè)過程中的幾個關(guān)鍵控制點進行闡述:
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01 PCR實驗室質(zhì)量管理體系
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根據(jù)實驗室的具體情況編寫質(zhì)量體系文件，《質(zhì)量手冊》、《程序文件》、《作業(yè)指導(dǎo)書》，并保證管理體系運行有效。
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管理體系的特點是應(yīng)有明確的目的、規(guī)范的管理、有效的制約、高效的機制、能自我發(fā)展的整體。
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建立完善的SOP文件，對完成各項質(zhì)量活動的方法作出規(guī)定，每個SOP都應(yīng)對一個或一組相互關(guān)系的活動進行描述。
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每個SOP文件應(yīng)說明該項質(zhì)量各環(huán)節(jié)的輸入、轉(zhuǎn)換和輸出所需的文件、物資、人員、記錄以及它們與有關(guān)活動的接口關(guān)系。
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明確每個環(huán)節(jié)轉(zhuǎn)換過程中各項因素的要求，即由誰做、做什么、做到什么程序、達到什么要求，如何控制、形成什么記錄和報告，以及相應(yīng)的審批手續(xù)。
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規(guī)定在質(zhì)量活動中需要注意的例外或特殊情況的糾正措施。SOP應(yīng)簡練、明確和易懂并且工作人員熟練掌握和嚴(yán)格遵守。
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02 PCR實驗室的相關(guān)設(shè)置
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要完成一組PCR實驗，通常需要經(jīng)過試劑配制、樣品處理、核酸擴增和產(chǎn)物分析4個實驗過程。
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這4個實驗過程的實驗用房應(yīng)相鄰布置，組成一個獨立的PCR實驗區(qū)。標(biāo)準(zhǔn)的PCR實驗區(qū)包括:試劑準(zhǔn)備區(qū)、標(biāo)本制備區(qū)、擴增區(qū)、產(chǎn)物分析區(qū)、各區(qū)配套的緩沖區(qū)及公共走廊。
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PCR實驗室整體平面布局
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某醫(yī)院PCR實驗室平面布局如圖1所示，整個區(qū)域有一個公用走廊，每個獨立實驗區(qū)設(shè)有專門的緩沖區(qū)。通過壓差控制，使整個PCR實驗過程中試劑和標(biāo)本免受氣溶膠的污染，并且降低擴增產(chǎn)物對人員和環(huán)境的污染。
圖表1、某醫(yī)院PCR實驗室平面圖
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1.試劑準(zhǔn)備區(qū)
該實驗區(qū)主要進行的操作為貯存試劑的制備、試劑的分裝和主反應(yīng)混合液的制備。
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試劑和用于標(biāo)本制作的材料應(yīng)直接運送至該區(qū)，不得經(jīng)過其他區(qū)域。試劑原材料必須貯存在本區(qū)內(nèi)，并在本區(qū)內(nèi)制備成所需的貯存試劑。
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試劑準(zhǔn)備區(qū)配備有2~8°C冰箱和-80°C冰箱，計算冷負荷時，需要將它們計算在內(nèi)。
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房間的面積宜控制在15m2~20m2。本區(qū)的壓力梯度要求為:相對正壓狀態(tài)，以防止外界含核酸氣溶膠的空氣進入，造成污染。
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2.標(biāo)本制備區(qū)
該區(qū)域主要進行的操作為臨床標(biāo)本的保存、核酸(RNA、DNA)提取、貯存及其加入至擴增反應(yīng)管和測定RNA時cDNA的合成。
標(biāo)本制備區(qū)配備有2~8°C冰箱和-20°C冰箱，計算冷負荷時，需要將它們計算在內(nèi)。在標(biāo)本制備區(qū)，還需要配備生物安全柜，用于進行提取核酸的操作。
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為避免提取的核酸在柜內(nèi)反復(fù)循環(huán)，造成標(biāo)本之間的交叉污染，出現(xiàn)假陽性結(jié)果，該區(qū)域配備的生物安全柜必須是B2型的。生物安全柜工作區(qū)垂直氣流全部來自實驗室，排風(fēng)經(jīng)過高效過濾器過濾后直接排至室外，不允許回到安全柜和實驗室中。
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根據(jù)經(jīng)驗，如果實驗室內(nèi)配備生物安全柜，每配備一臺，實驗室的面積增加10m2;標(biāo)本制備區(qū)的面積宜在25m2~30m2之間。本區(qū)的壓力梯度要求為:相對于鄰近區(qū)域為正壓，以避免從鄰近區(qū)進入本區(qū)的氣溶膠污染。
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3.擴增室
該區(qū)域主要進行的操作為DNA或cDNA擴增。此外，已制備的DNA模板和合成的cDNA(來自樣本制備區(qū))的加入和主反應(yīng)混合液(來自試劑貯存和制備區(qū))制備成反應(yīng)混合液等也可在本區(qū)內(nèi)進行。
在巢式PCR測定中，通常在第一輪擴增后必須打開反應(yīng)管，因此巢式擴增有較高的污染危險性，第二次加樣必須在本區(qū)內(nèi)進行。
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擴增室主要配備PCR實驗室的核心儀器PCR儀。
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在實驗室建造過程中，需要給PCR儀配備專門的UPS電源，以保證其正常工作。該區(qū)面積控制在15m2~20m2。
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本區(qū)的壓力梯度要求為:相對于鄰近區(qū)域為負壓，以避免氣溶膠從本區(qū)漏出。為避免氣溶膠所致的污染，應(yīng)盡量減少在本區(qū)內(nèi)的不必要的走動。個別操作如加樣等應(yīng)在超凈臺內(nèi)進行。建議采用5~10Pa壓差，在控制上比較容易實現(xiàn)。
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4.產(chǎn)物分析區(qū)
該區(qū)域主要進行的操作為擴增片段的測定。如使用全自動封閉分析儀器檢測，此區(qū)域可不設(shè)。
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在室內(nèi)配備通風(fēng)櫥，保證房間內(nèi)的相對負壓，空氣從室外流向室內(nèi)。該區(qū)面積控制在15m2~20m2。
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本區(qū)是最主要的擴增產(chǎn)物污染來源，因此對本區(qū)的壓力梯度的要求為:相對于鄰近區(qū)域為負壓，以避免擴增產(chǎn)物從本區(qū)擴散至其它區(qū)域。建議采用5~10Pa壓差，在控制上比較容易實現(xiàn)。
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03 正負壓區(qū)域緩沖室的設(shè)置
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根據(jù)壓力梯度的要求，試劑配制室和樣品處理室為相對正壓，擴增室和產(chǎn)物分析室為相對負壓，要求正壓的區(qū)域和要求負壓的區(qū)域的緩沖室內(nèi)的壓力設(shè)計大不相同。
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正壓緩沖室符合一般正壓潔凈室的緩沖原則，主要是防止室外環(huán)境空氣中的氣溶膠進入室內(nèi)。
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負壓緩沖室則是要求緩沖室對核酸擴增室及產(chǎn)物分析區(qū)保持正壓，對緩沖室外也保持正壓(主要是滿足室內(nèi)凈化需要，如室內(nèi)無潔凈要求，此處可以為0壓)。
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04污染的預(yù)防與控制
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PCR實驗室設(shè)計的核心問題是如何避免污染。在實際工作中，常見的有以下幾種污染類型:擴增產(chǎn)物的污染;天然基因組DNA的污染;試劑的污染以及標(biāo)本間的污染。因此要避免污染，首先應(yīng)是預(yù)防，而不是排除。
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·??? 工作區(qū)域的嚴(yán)格劃分，各個實驗區(qū)域要有明顯的標(biāo)記(如醒目的門牌或不同的地面顏色等)，以避免各個不同實驗區(qū)域設(shè)備物品、試劑等發(fā)生混淆。
·??? 合理的系統(tǒng)設(shè)置，合理的空調(diào)通風(fēng)系統(tǒng)設(shè)置，盡量采用全送全排的空調(diào)系統(tǒng);嚴(yán)格的氣流壓力控制，保證不同的實驗區(qū)內(nèi)不同的壓力要求。
·??? 規(guī)范的操作，臨床基因擴增檢驗實驗室的技術(shù)人員必須進行上崗培訓(xùn)，在實驗操作過程中，操作者必須戴手套，并經(jīng)常更換。清潔工作及時、正確。實驗工作結(jié)束后，必須立即對本區(qū)進行清潔。
·??? 嚴(yán)格的管理:嚴(yán)格控制進出實驗室的人員。在各個實驗區(qū)域使用帶有明顯區(qū)別標(biāo)志的工作服(如不同顏色)，當(dāng)工作人員離開時不得將本區(qū)的工作服帶至其它區(qū)域;盡量減少在實驗區(qū)內(nèi)不必要的走動以減少交叉污染的可能性。擴增產(chǎn)物分析區(qū)是最主要的擴增產(chǎn)物污染來源，廢液不能在實驗室中傾倒，必須經(jīng)消毒液浸泡消毒后在遠離實驗室的地方棄掉，用過的吸頭等一次性材料也應(yīng)經(jīng)消毒液浸泡消毒后統(tǒng)一處理，如焚燒等;
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新冠病毒核酸檢測的實驗室要求
1.核酸檢測過程包括標(biāo)本處理、核酸提取，進行PCR檢測等多個步驟，平均檢測時間需要2-3個小時。由于它是直接對我們采集標(biāo)本中的病毒核酸進行檢測，特異性強，敏感度相對較高，是當(dāng)前主要的檢測手段。
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2.《關(guān)于做好防范疫情輸入相關(guān)城市新型冠狀病毒檢測工作的通知》聯(lián)防聯(lián)控機制綜發(fā)〔2020〕128號文件中要求：加強實驗室檢測質(zhì)量控制，開展檢測的實驗室應(yīng)當(dāng)使用經(jīng)藥監(jiān)部門批準(zhǔn)的檢測試劑和采樣拭子。疾控機構(gòu)實驗室開展PCR檢測應(yīng)當(dāng)具備相應(yīng)條件。醫(yī)療機構(gòu)實驗室開展PCR檢測應(yīng)當(dāng)按照要求通過技術(shù)審核，在省級衛(wèi)生健康行政部門登記備案。
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疾控機構(gòu)和醫(yī)療機構(gòu)實驗室開展新型冠狀病毒檢測，均應(yīng)當(dāng)納入質(zhì)量控制體系，開展實驗室室內(nèi)質(zhì)控和室間質(zhì)評工作，并符合實驗室生物安全要求。醫(yī)學(xué)檢驗實驗室開展新冠病毒相關(guān)檢測，應(yīng)當(dāng)符合《醫(yī)學(xué)檢驗實驗室基本標(biāo)準(zhǔn)（試行）》《醫(yī)學(xué)檢驗實驗室管理規(guī)范（試行）》等要求，保證生物安全和遺傳資源管理符合相關(guān)規(guī)定。
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3. 《新型冠狀病毒實驗室生物安全指南（第二版）》國衛(wèi)辦科教函﹝2020﹞70號 、《新型冠狀病毒肺炎防控方案（第五版）附件<新型冠狀病毒肺炎實驗室檢測技術(shù)指南>》國衛(wèi)辦疾控函〔2020〕156號均提出：根據(jù)目前掌握的新型冠狀病毒的生物學(xué)特點、流行病學(xué)特征、臨床資料等信息，該病原體暫按照病原微生物危害程度分類中第二類病原微生物進行管理。具體要求：感染性材料或活病毒在采用可靠的方法滅活后進行的核酸檢測、抗原檢測、血清學(xué)檢測、生化分析等操作應(yīng)當(dāng)在生物安全二級實驗室進行。
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4. 國家衛(wèi)生健康委員會辦公廳《關(guān)于進一步加強新冠肺炎疫情防控期間發(fā)熱門診設(shè)置管理和醫(yī)療機構(gòu)實驗室檢測的通知》國衛(wèi)辦醫(yī)函〔2020〕263號中要求三級綜合醫(yī)院均應(yīng)建立符合生物安全二級及以上標(biāo)準(zhǔn)的臨床實驗室，有條件的專科醫(yī)院、二級綜合醫(yī)院也應(yīng)當(dāng)完善相關(guān)配備，提高冠狀病毒核酸檢測能力。
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5.《病原微生物實驗室生物安全管理條例》2018年修改：第二十五條 新建、改建或者擴建一級、二級實驗室，應(yīng)當(dāng)向設(shè)區(qū)的市級人民政府衛(wèi)生主管部門或者獸醫(yī)主管部門備案。
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6.《關(guān)于進一步做好疫情期間新冠病毒檢測有關(guān)工作的通知》聯(lián)防聯(lián)控機制綜發(fā)〔2020〕152號：落實實驗室備案或準(zhǔn)入要求，依法依規(guī)檢測。
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新冠病毒檢測應(yīng)當(dāng)由符合條件的醫(yī)療機構(gòu)（包括獨立設(shè)置的醫(yī)學(xué)檢驗實驗室）和疾控機構(gòu)開展。醫(yī)療機構(gòu)開展病原學(xué)檢測應(yīng)當(dāng)具備在設(shè)區(qū)的市級人民政府衛(wèi)生健康主管部門備案的生物安全二級及以上實驗室資質(zhì)，且符合《醫(yī)療機構(gòu)臨床基因擴增檢驗實驗室管理辦法》（衛(wèi)辦醫(yī)政發(fā)〔2010〕194號）的要求，具有PCR實驗室條件。